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本制品是一种采用荧光共振能量转移(FRET)的方法快速高灵敏检测血管紧张素转换酶2(ACE2)活性的试剂盒。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆以及肺、肠、肝脏等组织或细胞样品的检测。不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选的自动化操作系统。

MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，这两个荧光基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7～10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到ACE2蛋白酶的底物(Substrate)的两端。当ACE2没有切割底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA的荧光而导致检测不到荧光；当该底物被ACE2切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA的荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA的荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测ACE2蛋白酶的酶活性。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。

• 本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。96孔板中通常1～10μL细胞或组织样品足够用于ACE2酶活性检测。
  
• 本试剂盒使用灵活，检测速度快。本试剂盒中提供了ACE2酶阳性对照(Positive Control)，便于检测体系的建立。本试剂盒采用一步法检测，简单快速，全程约0.5～1h即可完成。

• Assay Buffer、Substrate和10mM MCA Standard需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。10×Positive Control使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
  
• 如果使用本试剂盒提供的Lysis Buffer制备样品，并且加入的样品量在本试剂盒的推荐范围内，可以确保反应体系的pH值在适宜的范围内。如果使用自行配制的裂解液，请确保加入样品后反应体系的pH值在6.5～7.0之间，或者确保样品的pH值在6.5～7.0之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。
  
• 体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。
  
• 尽管经测试本试剂盒中的10×Positive Control反复冻融5次对活性基本没影响，为取得良好的检测效果，建议第一次使用时适当分装保存。10×Positive Control融解后可能会有少量不溶物，属正常现象。尽量充分溶解后，离心取上清使用即可。
  
• 虽然本试剂盒中的ACE2底物有很高的特异性，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建议进一步使用ACE2抑制剂(MLN-4760)进行验证。
  
• 检测时建议使用96孔黑板，推荐选购黑色96孔板。
  
• 细胞、组织等裂解样品如果置于4℃保存，用于ACE2活性检测时，保存的时间不应超过2天，否则会影响检测结果的准确性。通常细胞、组织等裂解样品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。

• 样品的准备：
  
  • 血液样品的准备。
    对于血清样品，将全血在常温如25℃下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20℃或-80℃。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
    
  • 细胞或组织样品的准备。
    对于培养的贴壁细胞，PBS溶液洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100～500×g,5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100～200μL Lysis Buffer的比例加入Lysis Buffer，适当吹打，冰浴5～10分钟以充分裂解细胞。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μL Lysis Buffer的比例进行匀浆。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
• 试剂盒的准备：
  将Assay Buffer、Substrate和MCA Standard等试剂平衡至室温后分别混匀备用。10×Positive Control存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
  
• 阳性对照的准备：
  取适量的10×Positive Control并加入Assay Buffer对10×Positive Control进行10倍稀释。例如，取5μL 10×Positive Control，加入45μL Assay Buffer，混匀，即得50μL 1×Positive Control。96孔板检测时，通常每孔10μL 1×Positive Control即可。
  
• MCA标准曲线的设置：
  取2μL MCA Standard (10mM)，加入198μL Assay Buffer，混匀，即为200μL 100μM的MCA溶液，分别取0、2.5、5、10、20、30、40、50μL的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay Buffer补足至100μL，此时，MCA标准曲线的各孔MCA浓度和物质的量分别为0、2.5、5、10、20、30、40、50μM或0、0.25、0.5、1、2、3、4、5nmol。也可自行设置适宜的MCA浓度进行标准曲线的设定。
  
• 检测体系的设置：
  参照下表依次加入试剂盒各组分及样品。初次检测时，待测样品可以稀释一系列浓度梯度，以确保最终检测值在标准曲线线性范围内。待测样品的稀释倍数记为dil。
  

  待测样品	空白对照	阳性对照	待测样品
  Assay Buffer	88μL	88μL	88μL
  1×Positive Control	-	10μL	-
  Lysis Buffer	10μL	-	-
  待测样品	-	-	10μL
  总体积	98μL	98μL	98μL

  • 为获得更加可靠的检测结果，推荐每个样品设置3个复孔。
• 检测：
  
  • 振荡混匀1～2分钟，确保混合充分。
    
  • 除MCA标准曲线外每孔加入2μL Substrate，混匀。
    • 加入Substrate后反应会立即开始，如果孔数较多的情况下，建议在低温或使用排枪操作以减小各孔间加入Substrate的时间差而导致的误差，混匀操作可在培养板振荡器上进行。
  • 混匀后立即使用荧光酶标仪进行荧光测定。设置荧光酶标仪温度为37℃，激发波长为325nm、发射波长为393nm，每5分钟或10分钟读取一次数值。
    
    • 连续测定的时间可以根据待测样品中ACE2的酶活性进行调整，但是需确保获得6个点以上的数据。对于ACE2的酶活较高的样品，建议测定总时间为20分钟或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟；对于ACE2的酶活很低的样品，可以延长测定总时间为1至2小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟。
      
    • 如果荧光酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是室温条件下的酶活性，此时酶活性可能会偏低一些，不同的实验条件偏低的程度会有所不同。
• 计算：
  
  • 计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照、RFU阳性对照和RFU待测样品。RFU，Relative Fluorescence Unit。选取待测样品组MCA荧光强度呈线性关系的时间点的数据用于分析，记录呈线性关系的时间间隔为T，时间间隔T内的荧光强度变化量为ΔRFU，即ΔRFU= RFU待测样品(Time b) - RFU待测样品(Time a)。
    
  • 也可以直接比较各个样品在一定时间内的ΔRFU而确定样品的ACE2相对活性，但须确保最终时间点时RFU读数未达平台。
    
  • 也可将标准曲线各孔的荧光值减去标准品零浓度孔的荧光值，建立MCA标准曲线。将ΔRFU代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中MCA的生成量(记录为A)。MCA的标准曲线请参考图2A，MCA在0.02-5nmol (即0.2～50μM)范围内有良好的线性关系。ACE2蛋白酶活性的计算公式如下：
    ACE2 Activity (nmol/min/mg或U/mg) = A×dil/(V_sample×T×C)
    V_sample为检测时待测样品的体积(V_sample=10μL =0.01mL)；
    A为步骤7c根据标准曲线确定的MCA的生成量(nmol)；
    dil为步骤5中样品稀释倍数；
    C为样品蛋白浓度(mg/ml，检测步骤参考增强型BCA法蛋白浓度测定试剂盒或去垢剂兼容型Bradford蛋白浓度测定试剂盒)；
    T为步骤7a中反应时间(min)。
    酶活力单位的定义为：温度37℃条件下，每分钟催化生成1nmol MCA酶量定义为一个单位(U)。
    
  • 虽然本试剂盒中的ACE2底物已经比较特异，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建议进一步使用ACE2特异性抑制剂MLN-4760进行验证。
    
    图2.ACE2活性荧光检测试剂盒的MCA标准曲线和对ACE2阳性对照及组织样品的检测效果图。
    A.本试剂盒的MCA标准曲线示意图。
    B.不同量的ACE2 Positive Control(1×)酶切底物，生成产物的荧光强度示意图。
    C.小鼠不同组织的ACE2酶活性检测效果及MLN-4760的抑制效果。总蛋白量都为10μg，抑制剂为MLN-4760，终浓度为500nM)。
    D.ACE2 Positive Control(1×，10μL)及抑制剂MLN-4760 (终浓度为500nM)在293T细胞裂解液中的检测效果(总蛋白量为22μg)。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。